막연히 "파이썬" 하시니까 '파이썬의 어디에 무슨 체크박스가 있다는 거지...' 싶긴 합니다만(아마 tkinter겠지만...) 묻고 계신 기능 논리에 대해서만 힌트를 드리자면:

1. 체크박스가 몇 개가 있든지, 그 모든 체크박스가 특정 박스 B 안에 들어가 있다는 공통점을 갖게 합니다.
2. B 안의 어떤 체크박스든지, 체크되거나 체크 해제되거나 할 때, 항상 다음을 실행하게 합니다:
   • B 안에서 현재 체크된 상태인 체크박스가 몇 개인지 세어라. 그 수가 2보다 작다면 아무 일도 하지 마라.
   • 만약 2개 이상의 체크박스가 체크된 상태라면, 모든 체크박스에 대해서 다음을 수행하라:
     1. 체크된 것은 그대로 내버려둘 것.
     2. 체크되지 않은 것은 비활성화 처리할 것.

대강 이렇게 하시면 될 겁니다.
이해가 잘 안 되신다면 누가 자바스크립트로 짜놓은 예제를 돌려 보세요. (아주 똑같은 전개는 아닌데 그래도 대강 기본 아이디어는 비슷합니다.)